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_SLIDE_1_
Ligation &
Transformation
_SLIDE_2_
Cloning vector
목적인 DNA를 삽입하여 대장균 등에서 증폭, 유지하기 위한 매개체로, vector DNA는 제한효소로 절단하여 상보적인 절단부위를 갖는 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주균에 도입할 수 있다
목적 DNA 단편을 연결한 vector DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 목적 DNA단편을 대대로 유지할 수 있다
Cloning vector의 종류
- Plasmid : pBR322, pUC18
- Phage : lambda phage, M13 phage
- Cosmid : Cos(from lambda phage) + plasmid
- Artificial chromosome(인공 염색체) :
BAC (Bacterial Artificial Chromosome),
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
_SLIDE_3_
Plasmid vector의 장점
1. 복제기점(origin of replication)을 갖기 때문에 증식할 수 있다
2. 항생제 내성 유전자 (antibiotic resistance gene)
을 가져 selection marker로 사용될 수 있다
3. Multi cloning site(MCS)가
존재하여 원하는 유전자를 끼워 넣을…(생략)
4. 16˚C에서 4시간 이상 반응시킨다
E.coli(대장균)내에서 lactose 대사에 연관되는 유전자들의 se
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_SLIDE_9_
형질전환(Transformation)
외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 생물체의 유전적인 성질이 변하는 것을 형질전환 (Transformation)이라 한다
형질전환은 아주 오래 전부터 박테리아들이 유전적 다양성을 확보하여 생존 확률을 높이기 위해 사용한 전략으로써 1928년 영국의 그리피스가 폐렴쌍구균을 이용하여 실시한 실험이 계기가 되어 발견되었다
_SLIDE_10_
Competent cell
이러한 종을 효과적으로 형질전환(transformation)하기 위하여 DNA 도입능력을 강화하는 물리적이거나 화학적인 처리를 거쳐야만 한다. 이러한 처리를 받은
세포를 “competent cell” 이라고 한다
대장균( E. coli )을 포함해서 대부분의 박테리아는 일반적인 조건에서 제한된 양의 DNA만을 도입한다
_SLIDE_11_
형질전환된 세포의 선택 (Selection marker)
세균의 전체 세포 수에서 형질전환(transformation)된 세포는 일부분이므로, 형질전환 되지 않은 세포들 사이에서 plasmid를 갖게 된 세포(transformant) 를 선별할
때 Selection marker를 사용한다
_SLIDE_12_
형질 전환된 박테리아는 ‘heat-shock’ 처리 이후 즉시 항생제가 처리된 배지에 배양하는 것이 아니라, 항생제가 없는
액체배지에 먼저 넣고 1시간 정도 배양시켜야 하는데 이 시간동안 플라스미드 복제와 발현이 시작되고 항생제 저항성 단백질이 충분히 합성되어 이후에 항생제가
처리된 배지에서 세포가 살아남을 수 있게 된다
항생제 저항성은 형질 전환된 세포 내에 플라스미드(plasmid)가 존재하기 때문이며, 플라스미드의 저항성 유전자가 발현되어야 항생제를 해독하는 효소가 합성되어진다
_SLIDE_13_
재조합 분자의 확인 (Lac selection)
Lac operon
E.coli(대장균)내에서 lactose 대사에 연관되는 유전자들의 se
ligation & transformation.pptx
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