생쥐 난자 채취 및 발생 관찰

(3) Maturation Promoting Factor (MPF)
MPF는 1971년에 Masui와 Markert등에 의해 보고되었으며, 핵막의 붕괴와 염색체 농축 및 난할에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 성숙한 생쥐의 난자에 존재하는 활성이 큰 MPF는 양서류나 불가사리의 난자에서 핵막 붕괴를 유도할 수 있다. 또한 양서류와 불가사리의 경우 체세포 분열 중인 세포에서 추출한 MPF는 제 1 감수분열 중기에 정지되어 있는 미성숙 난자에서 핵막 붕괴를 일으킨다. 포유류에서는 성숙한 난자와 중기에 정지되어 있는 상실배에서 활성이 강한 MPF가 존재한다. 이 MPF의 활성은 세포주기 중 간기에서는 사라지고 중기에서 강력하게 나타난다. 이상의 연구는 MPF의 활성이 각 종에만 제한되지 않는 보편적인 것이며, 감수분열과 체세포 분열 모두에 특이적인 것임을 암시하고 있다.
(4) Dibutyryl cyclic adenosine monophosphate (dbc AMP)
dbc AMP는 cAMP의 derivative로서 세포막 투과가 가능하므로 외부에서 처리하면 세포내 cAMP의 농도를 높이는 효과를 나타낼 수 있다. 배양하는 난자에 dbc AMP를 처리하면 성숙이 억제됨이 보고되었다.
그림…(생략)

(A) 2세포기 (B) 4세포기 (C) 8세포기 (D) 초기 상실기 (E) 후기 상실기 (F) 포배기

(2) 실험방법-1

1. 3주된 암컷 생쥐를 경추 분리하여 도살한다.

2. 도살된 암컷 생쥐를 복측이 위로 향하도록 눕힌 다음 사지를 눌러 넓게 펴준다.

3. 복부에 70% 알코올을 뿌린 다음 티슈로 닦아 준다.

4. 복부의 스킨을 정중선과 수직으로 되게 약 1cm 정도 절개한 후 양쪽으로 잡아 당겨 두부 및 미부 측으로 스킨을 완전히 잡아 당긴다.

5. 복근을 가위로 잡고 같은 방식으로 절개하여 복부 내용물을 완전히 노출시킨다.

6. 열린 복강내의 소화 기관들을 한쪽으로 치우면 자궁과 좌우측의 신장 근처에서 난소를 찾을 수 있다.

7. 난소를 적출하여 혈액과 주변 조직을 제거하고, 미리 데워둔 CZB 배양액(glucose 함유)이 들어 있는 35 mm petri dish내에 옮긴 다음 세척한 후 난소를 forcep을 이용해서 터뜨린다

8. 완전히 난포를 터뜨린 후 난소를 제거하고 미세피펫을 사용하여 난모(卵母)세포를 회수한다.

9. 난모(卵母)세포를 Pasteur pipette으로 빨아올려 새로운 35 mm dish내의 2㎖의 CZB 배양액(glucose 함유) 내에서 3회 washing 한다.

10. CZB 배양액(glucose 함유) drop 든 35 mm dish와 dbc AMP(0.1mg/ml)와 Bisindolylmaleimide l (10μM)가 들어 있는 CZB 배양액(glucose 함유) drop이 든 35 mm dish로 drop당 2-3개의 난모(卵母)세포를 옮긴 후 37℃ CO2 배양기에서 배양한다.

(2) 실험방법-2

1. mating한 후 2-3일된 8주된 암컷 생쥐를 경추 분리하여 도살한다.

2. 도살된 암컷 생쥐를 복측이 위로 향하도록 눕힌 다음 사지를 눌러 넓게 펴준다.

3. 복부에 70% 알코올을 뿌린 다음 티슈로 닦아 준다.

4. 복부의 스킨을 정중선과 수직으로 되게 약 1cm 정도 절개한 후 양쪽으로 잡아 당겨 두부 및 미부 측으로 스킨을 완전히 잡아 당긴다.

5. 복근을 가위로 잡고 같은 방식으로 절개하여 복부 내용물을 완전히 노출시킨다.

6. 자궁-난관 이행부 이후를 잘라서 CZB 배양액(glucose 함유)이 든 dish에 넣는다.

7. 1 ml 주사기에 30 gauge 주사침을 달아서 자궁-난관 말단으로부터 배양액을 관류시키고 자궁경 말단으로부터 각각 1 회씩 관류한다.

8. 분리한 초기배를 mineral oil속에 있는 CZB 배양액(glucose 함유) drop속으로 넣은 다음 현미경으로 관찰한다.