박테리아의 형질 변화 (II)

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5a colony를 SOB medium 3 ml(20 mM이 되도록 2 M MgCl2를 30 ml 첨가)에 접종한 후 밤새 키운다. 효율을 증가시키기 위해서는 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 streak한 plate를 사용하는 것이 좋다.

2. 위에서 자란 균 2 ml를 200 ml의 SOB medium(20 mM이 되도록 2 M MgCl2 를 2 ml 첨가)에 다시 접종한 후 O.D.600이 0.4가 될 때까지 shaking incubator에서 키운다. 보통 약 3～4시간이 소요되며, 약 2시간 이후부터 30분마다 O.D.를 계속 측정해보는 것이 좋다(효율을 증가시키기 위해서 배양된 세균 수가 108 cells/ml를 넘지 않는 것이 좋다). 이론상 E.coli는 최적 조건에서 doubling time이 20분이므로 이에 맞추어 시간을 추정해 볼 수 있으나 배양조건을 고려해야 한다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube 4개에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 배양 부피의 1/3(tube당 15 ml) 되는 frozen storage buffer(FSB)에 세포침전물을 부유 시킨 다음, 두 tube씩 합쳐서 30 ml 씩으로 만든 후 얼음에 10분 놓아둔다. FSB의 성분은 표 1과 같다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 처음 배양 부피의 1/12.5(tube 당 8 ml)되는 FSB에 부유시키고, 두 tube를 합쳐서 16 ml로 만든다.

7. DMSO를 3.5%(V/V)만큼 가한다(560 ml). 이때 DMSO는 세포 부유액의 중앙에 떨어뜨리고 곧바로 tube를 기울이면서 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.

8. 얼음에 5～15분 놓아둔다.

9. 다시 같은 양의 DMSO를 가하여 최종 농도가 7%(V/V)이 되도록 하고, 얼음에 10~15분 둔다.

10. 미리 차게 해 둔 microfuge tube에 200 ml 씩 분주한다.

11. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다. 상온에 나와 한번 녹았던 competent cell은 다시 보관할 경우 효율이 대단히 감소하므로 버려야 한다.