[의학,약학] [미생물실험] PURIFICATION OF PLASMID DNA(bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해)

PURIFICATION OF PLASMID DNA

1. subject

bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다.

2. introduction

가. plasmid세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다.
나. vector필요한 유전자를 잘라내어 플라스미드에 삽입한 후 재조합된 플라스미드를 세균안에 집어 넣는다. 숙주 내 플라스미드의 증식에 따라서 필요한 유전자가 복제되고 유용한 물질들이 합성된다. 이때 플라스미드는 유전자를 운반하는 역할을 하기 때문에 벡터 (vector 운반체)라고 불려진다…(생략)

다. pGEM-T vectror

1) T-vectorT-vector는 PCR을 마친후 증폭된 DNA의 절편을 보관이나 다른 용도에 편하게 쓸 수 있도록 만든 것이다. vector가 주로 circular form의 plasmid인데 비해 이것은 직선형이다. PCR 결과물을 T-vector와 연결하여 circular form으로 만들어 준 후에 E.coli에 transformation하는 방법으로 이용한다. T-vector는 이름에서 볼 수 있듯이 직선형 DNA의 양끝에 overhang(DNA가 2가닥인데 한가닥만 돌출되어있다)으로 T서열을 가지고 있다. 이렇게 양끝에 T를 넣어준 이유는 Taq polymerase(PCR용 DNA중합효소)를 이용해서 PCR을 한경우 원하는 서열 양끝쪽에 overhang으로 추가로 A 서열이 만들어지기 때문이다. 이 상태의 DNA를 연결ligation하여 변형transformation 시킨다.

2) pGEM-T easy vector kitT-vector은 만들기 어려워 거의 대부분 사서쓰는데 Promega의 pGEM-T vector가 그중에서 가장 널리 사용되는 것중에 하나로써 pGEM은 Promega라는 회사에서 사용하는 code명이다. 사용하기 편하며 ligation 효율도 높다.- Promega pGEM-T easy kit의 특징Rapid ligation solution을 가지고 있어서 보통 ligation하는데 16시간 정도 걸리지만 이것을 이용할 경우 1시간에서 3시간이면 반응이 끝나서 시간을 절약할 수 있어서 편하다.

라. plasmid 를 추출하는 일반적인 방법

1) 기본원리 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix를 형태를 가지는 반면 plasmid는 supercoiled형태를 가짐으로써 PH의 변화에 따라서도 plasmid의 형태 와 구조가 크게 변하지 않는 것을 이용하여 순수한 plasmid만을 추출하는 구조적 기본원리에 의한 방법이다.

2) 방법Bacterial culture tube에 LB(일반영양배지 Luria Bertani) broth(액체배지)와 antibiotic(항생제)가 포함되어있는 곳에 재조합된 bacteria의 single colony를 picking하여 접종한 후 배양한다 bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법으로 alkaline lysis procedure을 이용한다. Plasmid DNA는 plasmid를 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다. 여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosom