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title
mini preparation
object
DNA의 크기차이에 의해 분리하는 방법인 alkaline lysis method를 이용하여 정제된 DNA의 양을 불린다.
introduction
유전자 재조합은 DNA를 목적에 따라 적절히 자르고 붙여서 유전물질을 원하는 형태로 개조시키는 과정이다. 가장 기본적인 DNA조작기법인 재조합DNA(recombination DNA) 기술은 필요로 하는 외부 DNA단편을 vector라고 부르는 운반자 plasmid DNA분자에 연결시켜 목적으로 하는 DNA부분만 증폭시킬 수 있는 새로운 재조합 DNA를 만드는 것이다. 즉, 제한효소를 사용하여 목적 DNA와 plasmid DNA를 잘라 이 두 분자를 ligase를 사용하여 연결시키는 것이다. 이렇게 반응시킨 DNA용액을 대장균에 형질전환 시킨다. 이 때 원하는 DNA분자가 만들어졌는지를 조사하기 위하여 형질전환체 중 여러 colony를 후보로서 택하여 형질전환체 내에 들어있는 plasmid DNA를 조사하여야한다. 이 때 plasmid DNA분리에 사용되는 preparation(of plasmid DNA) 방법은 많은 후보를 빠른 시간에 분석하는데 유용하게 사용되어진다.
주로 minipreparation(mini prep.)이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 여러 가지 방법이 있지만 가장 보편적으로 쓰이는 방법이 Alkaline lysis method이다. 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하여 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 단, chromosomal DNA는 분리과정에서 linear형태가 되고 크기가 커서 대부분 침전의 형…(생략)
1. 세포벽을 깬다. 이 때 세포막은 유지되도록 한다. 세포벽을 군데군데 무너뜨리는 물질은 EDTA이며, 이 때 sucrose나 glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 한다. 때로는 lysozyme을 쓰기도 한다.
2. 세포막을 조심스럽게 깨서 크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것(너무 잘게 조각나게 되면, 그로 인해 plasmid DNA도 깨져버리게 된다.)을 방지하면서 용액에 DNA를 노출시킨다. SDS라는 detergent(이것을 이용하여 세포를 깬다. 이것이 지방 성분을 녹이기 때문이다.) 가 세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오게 된다. 이 때 바로 alkaline 용액에 노출된 DNA는 denature(다풀리는 것)된다. 그러나 크기가 작은 supercolied plasmid DNA는 잘 denature되지 않는다.
3. pH를 급격하게 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만 chromosomal DNA는 renature되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거한다. 우리가 얻고자 하는 plasmid DNA는 상층액에 존재하게 된다.
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