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Agarose gel electrophoresis＆ Gel elution
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전기영동
용액에 전류를 통했을 때 용액 중의 하전 입자가 양극 또는 음극으로 이동하는 현상
주로 단백질 관련 물질 또는 유사한 성질을 가진 물질이 대상
이동의 원리
DNA자체가 전체적으로 (-)전하를 띄고 있는 것을 이용한 것
시간이 지날수록 size별로 움직인 거리 차이가 나는 원리 이용
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전기영동법의 종류
이동 계면 전기영동 (moving-boundary electrophoresis)
띠 전기영동 (zone electrophoresis)
종이 전기영동
평판 겔 전기영동[polyacrylamide, agarose]
면역 전기영동
전분-겔 전기영동
원판 전기영동
SDS polyacrylamide 전기영동
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Gel electrophoresis(젤 전기 영동법)
Gel matrix에 전류를 흘려보내 DNA, RNA, 단백질 등을 분리하는 방법
Gel에 따른 차이
: Agarose gel / DNA와 RNA band
: SDS-PAGE, 2D-gel 전기영동 / 단백질 band
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평판 겔 전기영동
평판(slab)에서 동시에 여러 시료와 표준 물질을 분석 할 수 있는 기법.
Gel의 세공 크기를 조절하여 하전된 물질의 이동속도 결정.
대표적 Gel 물질: Agarose & Polyacrylamide.
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Polyacrylamide gel 전기영동
Polyacrylamide 농도:3~20% 가능
단…(생략)
1.2
2.0
3. EtBr binding 유무
4. Agarose gel의 EEO
① 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.
② 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다. 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 분말과 완충액을 삼각 플라스크 또는 유리병에 담는다.
③ Microwave oven를 이용하여 agarose가 녹을 때까지 서서히 가열한다.
④ 용액을 60°C까지 식힌다. 필요하면 ethidium bromide를 최종농도 0.5 μg/ml이 되도록 가하고 잘 혼합한다.
⑤ agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5～1.0 mm정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 comb를 고정시킨다.
⑥ 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붓는다. Gel은 3～5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.
⑦ 실온에서 20～30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.
5. QiAquick column
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밑바닥으로부터 0.5～1.0 mm정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 comb를 고정시킨다.
⑥ 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붓는다. Gel은 3～5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.
⑦ 실온에서 20～30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.
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Agarose gel 전기영동
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Buffers
TAE (Tris/Acetate/EDTA):비교적 긴 DNA를 전기영동시 사용
TBE (Tris/Borate/EDTA): 짧은 크기의 DNA를 전기영동시 사용
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Gel elution
DNA 전기영동 후 원하는 band를 gel로부터 분리
재조합 DNA를 만들 때 쓰이는 기술
회수율과 용출된 DNA의 순수도가 높고,좀 더 빠르고, 간편한 DNA 회수방법 계속 개발 중
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Gel elution 실험 방법
Gene을 특별한 primer와 함께 PCR로 증폭
Gel electrophoresis
전기영동 된 DNA를 cutting “Elution”
Cutting된 gel에서 DNA를 순수하게 회수
일부를 다시 Gel electrophoresis
남은 DNA중 증폭시키고자 하는 부분을 제한효소로 잘라냄
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Gel Elution 실험방법
Agarose gel로부터 DNA fragment를 자른다.
2. 1.5ml microcentrifuge tube 에 gel slice를 넣어 무게를 재고 QG buffer를 gel 무게의 3배만큼 첨가.
3. 50도에서 10min incubate, incubation 동안 매 2~3분마다 vortexing 하면서 mix
4. Sample에 gel volume의 동령으로 iso-propanol 첨가 & mix
5. QiAquick column
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전기영동,마케팅,브랜드,브랜드마케팅,기업,서비스마케팅,글로벌,경영,시장,사례.pptx
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